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CAR-T細(xì)胞療法GMP生產(chǎn)概述

1. GMP法規(guī)

近年來(lái),CAR-T療法在血液瘤治療方面表現(xiàn)出令人鼓舞的結(jié)果,2017年美國(guó)FDA批準(zhǔn)了兩款CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品上市,極大地鼓舞了細(xì)胞免疫治療研發(fā)熱情,CAR-T療法在某些血液腫瘤中具有顯著的療效,并預(yù)示著腫瘤治療模式的變革。CAR-T細(xì)胞療法在其它惡性腫瘤方面也進(jìn)行了深入的研究,部分產(chǎn)品已開(kāi)展了早期臨床試驗(yàn),以評(píng)估CAR-T細(xì)胞的安全性和有效性。FDA規(guī)定CAR-T細(xì)胞臨床試驗(yàn)樣品必須經(jīng)IND批準(zhǔn)在GMP條件下生產(chǎn)。

GMP法規(guī)見(jiàn)美國(guó)Federal Regulations第21篇的各個(gè)章節(jié)。它們涵蓋各種產(chǎn)品的制造,包括食品、小分子藥物等。CAR-T最相關(guān)的章節(jié)在第210和211部分中介紹,在FDA指南“CGMP for Phase I Investigational Drugs”中簡(jiǎn)要介紹了用于早期臨床試驗(yàn)的生產(chǎn)要求。討論的關(guān)鍵領(lǐng)域如表1所示,其中包括一個(gè)專(zhuān)門(mén)的章節(jié),涵蓋與細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品相關(guān)的問(wèn)題。

表1 FDA關(guān)于藥物臨床I期CGMP指南主要內(nèi)容

2. 廠房及設(shè)施

用于制造、加工或包裝CAR-T的任何建筑或設(shè)施應(yīng)具有適當(dāng)?shù)某叽?、位置,并采用適當(dāng)?shù)臐崈羰壹?jí)材料建造,以確保適當(dāng)?shù)那鍧?、維護(hù)和生產(chǎn)操作。制造設(shè)施中的每個(gè)指定工作區(qū)域必須有適當(dāng)?shù)目臻g供設(shè)備、材料和人員移動(dòng),以防止不同部件、過(guò)程中材料或不同CAR-T產(chǎn)品之間的混合,從而有助于防止污染。如果使用多產(chǎn)品制造設(shè)施,則需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕徊嫖廴狙芯框?yàn)證。

CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品、病毒載體和質(zhì)粒的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)分別在各自獨(dú)立的生產(chǎn)區(qū)域進(jìn)行,并配備獨(dú)立的空調(diào)凈化系統(tǒng)。采用密閉設(shè)備、管路進(jìn)行細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)操作;密閉設(shè)備、管路安置環(huán)境的潔凈度級(jí)別可適當(dāng)降低。同一生產(chǎn)區(qū)域有多條相同的生產(chǎn)線(xiàn),且采用隔離器的,每個(gè)隔離器應(yīng)當(dāng)單獨(dú)直接排風(fēng)。細(xì)胞治療產(chǎn)品、病毒載體、質(zhì)粒的生產(chǎn)操作環(huán)境的潔凈度級(jí)別,可參照表格中的示例進(jìn)行選擇。

每個(gè)B實(shí)驗(yàn)區(qū)域的空氣壓力保持在+50Pa大氣壓,每個(gè)級(jí)別的實(shí)驗(yàn)區(qū)域都有一個(gè)10-15Pa的空氣級(jí)聯(lián),沒(méi)有空氣再循環(huán);新鮮空氣通過(guò)終端Hepa過(guò)濾器進(jìn)入每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域,并通過(guò)低水平抽風(fēng)器排出。換氣速率從B實(shí)驗(yàn)區(qū)的70ac/H到D實(shí)驗(yàn)區(qū)的28ac/H不等。每個(gè)II類(lèi)微生物安全柜和提供A級(jí)環(huán)境的QUBE隔離器都進(jìn)行連續(xù)的顆粒監(jiān)測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都要與其他實(shí)驗(yàn)室完全隔離,以便用汽化過(guò)氧化氫進(jìn)行熏蒸。

目前CAR-T產(chǎn)品常見(jiàn)的生產(chǎn)環(huán)境有兩種:B+A和C+A(隔離器),需要明確的是,無(wú)論是哪種實(shí)現(xiàn)形式,按照無(wú)菌生產(chǎn)要求,所有生產(chǎn)環(huán)節(jié)不能離開(kāi)A級(jí)環(huán)境,這就要求對(duì)無(wú)菌生產(chǎn)要有充分的理解,否則將面臨合規(guī)性方面的挑戰(zhàn)。

B+A是大家首先考慮的生產(chǎn)環(huán)境實(shí)現(xiàn)形式,但這種方式面臨一個(gè)問(wèn)題是不能保證全程在A級(jí)環(huán)境下完成。C+A是現(xiàn)階段CAR-T產(chǎn)品無(wú)菌生產(chǎn)的一種理想方案。細(xì)胞制品生產(chǎn)過(guò)程中的隔離措施以隔離器為最佳,無(wú)菌生產(chǎn)的隔離器對(duì)環(huán)境的要求可以降低,而且可以將離心、培養(yǎng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)集成在隔離器內(nèi),實(shí)現(xiàn)全程的A級(jí)隔離。

在這些區(qū)域使用的材料和設(shè)備必須盡量減少顆粒物(使用潔凈室級(jí)鋼、其他材料等)和生物或化學(xué)污染的機(jī)會(huì)。應(yīng)監(jiān)測(cè)周期性好氧和厭氧微生物負(fù)荷。

圖1 GMP廠房設(shè)計(jì)

空氣處理裝置必須配備適當(dāng)?shù)脑O(shè)備,并通過(guò)書(shū)面文件、測(cè)試和定期維護(hù)對(duì)區(qū)域等級(jí)進(jìn)行驗(yàn)證。不同等級(jí)區(qū)域的空氣處理裝置應(yīng)根據(jù)其各自的管道而有所不同。

生產(chǎn)區(qū)和灌裝區(qū)必須明確劃分和隔離(必須保持人員和物料流動(dòng)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序)。必須將適當(dāng)?shù)念w粒計(jì)數(shù)器、微生物傳感器、空氣流量傳感器等放置在制造設(shè)施的工作區(qū)域,并保存記錄。

用于生產(chǎn)的潔凈室區(qū)域內(nèi)的所有儀器必須有校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,并提供定期維護(hù)的文件。設(shè)施必須定期進(jìn)行空氣過(guò)濾器、儀器等的維護(hù)驗(yàn)證,以確認(rèn)指定的分類(lèi)區(qū)域的維護(hù)。

工藝標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程必須包括安全方法,防止污染,定期測(cè)試污染物、微粒和風(fēng)險(xiǎn)最小化的方法。生產(chǎn)過(guò)程中的所有數(shù)據(jù)必須在有權(quán)限訪問(wèn)下安全存儲(chǔ),并在評(píng)估過(guò)程中提供。

3. 人員

生產(chǎn)負(fù)責(zé)人應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí)(如微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等),至少具有三年從事生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)或質(zhì)量管理的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。質(zhì)量負(fù)責(zé)人和質(zhì)量受權(quán)人應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)知識(shí),至少具有五年生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量管理的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),從事過(guò)生物制品或細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量保證、質(zhì)量控制等相關(guān)工作。

從事細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量保證、質(zhì)量控制及其他相關(guān)人員(包括清潔、維修人員)應(yīng)當(dāng)經(jīng)過(guò)接受良好的無(wú)菌程序、污染物測(cè)試、生產(chǎn)過(guò)程(根據(jù)批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程)和維護(hù)所有過(guò)程相關(guān)文件方面的培訓(xùn)。尤其是預(yù)防經(jīng)供體材料傳播疾病方面的知識(shí),以防止傳染性疾病的病原體在物料、產(chǎn)品和人員之間傳播以及對(duì)環(huán)境潛在的影響。

負(fù)責(zé)制造、相關(guān)工藝、包裝或搬運(yùn)的人員必須在制造設(shè)施內(nèi)始終穿著干凈、安全和適當(dāng)?shù)囊路?,并保持無(wú)菌條件(應(yīng)制定人員進(jìn)出的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程)。必要時(shí),應(yīng)穿戴覆蓋身體、頭部、面部、手和手臂的防護(hù)服,以防止產(chǎn)品受到污染(必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程)。員工必須養(yǎng)成良好的衛(wèi)生和健康習(xí)慣。從事質(zhì)粒和病毒載體制備和細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的人員不得穿越不同的生產(chǎn)區(qū)域。

4. GMP條件下CAR-T生產(chǎn)

4.1 生產(chǎn)流程

在設(shè)計(jì)CAR-T 細(xì)胞制造SOP時(shí),特別建議開(kāi)發(fā)一個(gè)封閉的,或功能封閉的制造過(guò)程,以降低產(chǎn)品污染的風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)流程

從在簡(jiǎn)單的T瓶和細(xì)胞培養(yǎng)袋中培養(yǎng)到在復(fù)雜的生物反應(yīng)器中制備,理想的系統(tǒng)應(yīng)該在功能上是封閉的,以減少污染的風(fēng)險(xiǎn),因此,大多數(shù)研究人員已經(jīng)放棄使用T形瓶。目前,應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)設(shè)備是G-Rex(Wilson Wolf Manufacturing)、Wave biorector(GE Life Systems)和CliniMACS Prodigy(Miltenyi Biotec)。

G-Rex專(zhuān)為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì),氧氣從底部透氣膜滲透進(jìn)入培養(yǎng)體系,細(xì)胞自然沉降至培養(yǎng)瓶底部,葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)自然對(duì)流至細(xì)胞,細(xì)胞可以用GatherRex(Wilson Wolf Manufacturing)收集至轉(zhuǎn)移包中進(jìn)行下游處理。

圖3 符合GMP要求的CAR-T細(xì)胞生產(chǎn)裝置G-Rex及GatherRex

旭日(Wave)生物反應(yīng)器是一個(gè)自動(dòng)化的封閉系統(tǒng),由一個(gè)放置在搖擺平臺(tái)上的透氣細(xì)胞培養(yǎng)袋組成。該系統(tǒng)配備流量控制器、氣體壓力傳感器、pH、氧氣和二氧化碳濃度傳感器等裝置。已經(jīng)成功地用于生產(chǎn)CAR-T,該系統(tǒng)可用于生產(chǎn)1-1000升的產(chǎn)品。

CliniMACS Prodigy全自動(dòng)多功能細(xì)胞處理系統(tǒng)符合歐盟GMP標(biāo)準(zhǔn),全封閉操作系統(tǒng),取代傳統(tǒng)方案中多個(gè)人工操作環(huán)節(jié)及相應(yīng)的儀器設(shè)備,輕松實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、全自動(dòng)CAR-T細(xì)胞制備過(guò)程,包括細(xì)胞富集、轉(zhuǎn)導(dǎo)、洗滌和擴(kuò)增,是目前應(yīng)用最廣泛的自動(dòng)化設(shè)備。在Prodigy裝置中,MACS CD4和CD8用于細(xì)胞富集,CD3/CD28試劑用于激活,慢病毒載體用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo),這些細(xì)胞在TexMACS培養(yǎng)基-3%HS-IL2中培養(yǎng),洗滌步驟采用PBS/EDTA緩沖液。用Prodigy裝置對(duì)起始細(xì)胞進(jìn)行洗滌,去除血小板,富集CD4+和CD8+細(xì)胞。約10%的CD8+ NK細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28活化和擴(kuò)增后大量清除。

4.2 生產(chǎn)控制

企業(yè)應(yīng)當(dāng)建立書(shū)面操作規(guī)程,規(guī)定供體材料和產(chǎn)品在接收、運(yùn)輸、生產(chǎn)、檢驗(yàn)、放行、發(fā)放過(guò)程中正確標(biāo)識(shí)與核對(duì)標(biāo)識(shí)信息的操作和記錄,確??勺R(shí)別供體且具有唯一性的編號(hào)代碼,不會(huì)發(fā)生標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤或遺漏,且具有可追溯性。企業(yè)應(yīng)當(dāng)制定供體篩查標(biāo)準(zhǔn),制訂供體材料采集、運(yùn)輸、接收標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,詳細(xì)說(shuō)明供體材料的采集方法、保存和運(yùn)輸條件以及接收的標(biāo)準(zhǔn)。

產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)采取措施盡可能防止污染和交叉污染,如:采用含有傳染性疾病病原體的自體供體材料進(jìn)行生產(chǎn)的,其生產(chǎn)、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不得接觸其它不含有傳染性疾病病原體的供體材料或產(chǎn)品;未采用密閉設(shè)備、管路生產(chǎn)的,不得在同一區(qū)域內(nèi)同時(shí)進(jìn)行多個(gè)產(chǎn)品或多個(gè)批次的生產(chǎn)操作,但產(chǎn)品已密封的培養(yǎng)操作除外;采用密閉設(shè)備、管路在多條生產(chǎn)線(xiàn)上同時(shí)生產(chǎn)同一品種的多個(gè)批次時(shí),應(yīng)當(dāng)采取有效措施規(guī)范人員、物料和廢棄物的流向;在密閉條件下進(jìn)行細(xì)胞?